雙光子共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡在進(jìn)行生物樣品研究工作中還存在很多局限和問(wèn)題：
一是標(biāo)記染料的光漂白現(xiàn)象。因?yàn)楣步箍讖焦怅@必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會(huì)擋掉很大部分從樣品發(fā)出的熒光，包括從焦平面發(fā)出的熒光，相應(yīng)的，激發(fā)光必須足夠強(qiáng)以獲得足夠的信噪比；而高強(qiáng)度的激光會(huì)使熒光染料在連續(xù)掃描過(guò)程中迅速褪色，熒光信號(hào)會(huì)隨著掃描進(jìn)程度進(jìn)行變得越來(lái)越弱。
光毒作用是另外一個(gè)問(wèn)題，在激光照射下，許多熒光染料分子會(huì)產(chǎn)生諸如單態(tài)氧或自由基等細(xì)胞**，所以實(shí)驗(yàn)中要限制掃描時(shí)間和激發(fā)光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對(duì)活性樣品的研究中，尤其是活性樣品生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程的各個(gè)階段，光漂白和光毒現(xiàn)象使這些研究受到很大的限制。
 在傳統(tǒng)熒光顯微鏡中，一個(gè)熒光團(tuán)吸收一個(gè)光子，該光子能量對(duì)應(yīng)于熒光團(tuán)基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差。通過(guò)一個(gè)較短壽命的虛態(tài)，也可以通過(guò)同時(shí)吸收兩個(gè)較低能量（即更高的波長(zhǎng)）的光子激發(fā)熒光。例如，吸收兩個(gè)紅色波長(zhǎng)的光子，可以激發(fā)一個(gè)吸收紫外的分子。雙光子激發(fā)是一個(gè)非線性過(guò)程，對(duì)激發(fā)光強(qiáng)度有平方依賴關(guān)系。
使用單激發(fā)光源，雙光子具有相同的波長(zhǎng)，該技術(shù)被稱為雙光子激發(fā)熒光顯微術(shù)。如果兩個(gè)光子具有不同的波長(zhǎng)，就稱作雙色激發(fā)熒光顯微術(shù)。
雙光子吸收幾率依賴于兩個(gè)入射光子在空間和時(shí)間上的重合程度（兩個(gè)光子必須在10－18秒內(nèi)到達(dá)）。雙光子吸收截面很小，對(duì)若丹明B一般為10－50cm4 s photon－1 molecule－1，這樣，只有在具有很大光子流量的區(qū)域的熒光團(tuán)才會(huì)被激發(fā)。鈦寶石激光器等鎖模的，高峰值功率激光可以為雙光子激發(fā)提供足夠的強(qiáng)度。
由于激發(fā)強(qiáng)度隨到焦平面的距離的平方變化，在z軸方向雙光子激發(fā)幾率隨離焦距離的四次方衰減，熒光團(tuán)激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn)內(nèi)。用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，激發(fā)波長(zhǎng)為780納米，全部激發(fā)熒光的80%被局限在焦平面1微米范圍內(nèi)，激發(fā)體積大約為0.1-1飛升，與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比，該體積降低了1010倍。
在激光掃描熒光顯微術(shù)中，雙光子激發(fā)具有三維層析能力，該三維層析效果可與共焦顯微鏡相比擬，它還比具有另外兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：因?yàn)檎彰鞴庠跁r(shí)間空間上匯聚，沒(méi)有離焦光漂白；激發(fā)光不會(huì)被離焦吸收衰減，因而有較大的穿透深度。
雙色激發(fā)比雙光子激發(fā)的優(yōu)勢(shì)并不在于較高的分辨率，而是在于小目標(biāo)物經(jīng)過(guò)較大散射媒質(zhì)后更容易觀察。事實(shí)上，與雙光子激發(fā)比較，雙色激發(fā)在焦點(diǎn)內(nèi)熒光散射增加，而干擾背景熒光只有很小增加。
    結(jié)合多光子熒光技術(shù)，多光子共聚焦顯微鏡（Multiphoton Excitation－MPE）的發(fā)展成功的解決了傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡（單光子共聚焦顯微鏡）所存在的問(wèn)題，MPE的激光源是超快激光器（多為鈦寶石激光器，可以達(dá)到皮秒或者飛秒級(jí)的掃描速度），具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收現(xiàn)象是非線性效應(yīng)，只發(fā)生在聚焦焦點(diǎn)處，不需要共聚焦孔徑光闌濾光，從而大大提高成像亮度和信噪比。在傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡中，光通過(guò)出的所有樣品都被激發(fā)，所以必須用孔徑光闌來(lái)選取焦點(diǎn)處樣品發(fā)出的熒光。孔徑光闌不僅遮擋了焦點(diǎn)以外樣品發(fā)出的熒光，而且也遮擋了焦點(diǎn)處散射和漫反射的熒光。在MPE中，焦點(diǎn)處發(fā)出的所有熒光，包括散射和漫反射的熒光都可以被收集并探測(cè)到。并且由于多光子實(shí)驗(yàn)所用的激發(fā)光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)，激發(fā)光的散射損失很小，軸向分辨率更高，樣品的穿透能力更強(qiáng)。